Osteoblastos são células fundamentais para formação e reparo do tecido ósseo e o processo de diferenciação osteoblástica é regulado pelo fator de transcrição relacionado à runt 2 (Runx2), além de inúmeras outras proteínas que atuam sobre vias de sinalização celular. Resultados do nosso grupo de pesquisa mostraram que a proteína da matriz extracelular agrin é expressa por células-tronco mesenquimais (MSCs) e osteoblastos e que essa proteína favorece a diferenciação osteoblástica de MSCs derivadas da medula óssea. No entanto, até o momento, não há dados na literatura acerca da participação de agrin na diferenciação osteoblástica de MSCs derivadas do tecido adiposo. Portanto, o objetivo desse estudo é investigar a participação de agrin sintetizada por células que expressam Runx2 na diferenciação osteoblástica de MSCs derivadas do tecido adiposo, utilizando camundongos transgênicos. Para isso, MSCs serão obtidas do tecido adiposo inguinal de camundongos Runx2- Cre;Agrinfl/fl (deleção de agrin) e Agrinfl/fl (controle) e serão cultivadas em condições osteogênicas por até 21 dias. Serão avaliadas: (1) a proliferação celular por contagem do número de células e (2) a expressão gênica de agrin e seus receptores, e de marcadores ósseos por PCR em tempo real, aos 3, 7 e 10 dias, (3) a atividade de fosfatase alcalina por marcação com Fast red, aos 10 dias e (4) a formação de matriz extracelular mineralizada por coloração com vermelho de Alizarina, aos 21 dias. Os dados serão submetidos ao teste de aderência à curva normal e homogeneidade de variâncias para determinar a análise estatística adequada. O nível de significância será de 5% (p d 0.05). Como agrin é ainda pouco explorada no contexto da biologia óssea, os resultados obtidos com o desenvolvimento desse projeto serão relevantes, uma vez que agrin pode ser uma proteína alvo para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que favoreçam formação e regeneração óssea, regulando eventos relacionados à diferenciação osteoblástica.

O secretoma contido no meio condicionado por células-tronco mesenquimais (MSCs) modificadas geneticamente para superexpressar proteína óssea morfogenética 9 (BMP-9) (MSCsBMP-9) favorece o reparo de defeitos ósseos criados em calvárias de camundongos. Como superfícies tridimensionalmente impressas na escala microtopográfica aumentam a diferenciação osteoblástica de MSCs, estabelecemos a hipótese de que o secretoma de MSCsBMP-9 cultivadas sobre uma superfície com microtopografia induz maior reparo ósseo do que o secretoma de MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície lisa. Assim, o objetivo desse estudo é Investigar o efeito do secretoma contido no meio condicionado por MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície com microtopografia no reparo ósseo de defeitos criados em calvárias de ratos. Os meios condicionados por MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície lisa ou com microtopografia serão coletados ao final de 4 horas. Defeitos de 5 mm de diâmetro serão criados em calvárias de ratos que serão distribuídos em grupos experimentais (n = 12 por grupo) de acordo com os seguintes tratamentos feitos por injeção local de: (1) meio não condicionado, (2) meio condicionado por MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície lisa e (3) meio condicionado por MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície com microtopografia. Os tratamentos serão realizados 2 semanas após a criação dos defeitos e, 4 semanas após o tratamento, o tecido ósseo formado será analisado por microtomografia computadorizada e cortes histológicos. Os dados quantitativos serão submetidos ao teste de aderência à curva normal para determinar o teste estatístico adequado a ser aplicado.

Biocerâmicas porosas denominadas de scaffolds vem sendo estudadas para a substituição e reparação óssea, com propriedades que atendam a funcionalidade e integração entre o biomaterial e o sistema biológico. Biocerâmicas de Al2O3 e Al2O3/ZrO2 são reconhecidas como biomateriais devido suas propriedades mecânicas melhoradas, alta estabilidade química e biocompatibilidade, quando comparada a outros materiais. No entanto, devido à natureza bioinerte da Al2O3 e ZrO2, recobrimentos superficiais são utilizados para melhorar a interação desse biomaterial com o tecido hospedeiro quando implantado, além de poder liberar íons que estimulem respostas celulares a nível molecular, através de mecanismos ainda não totalmente compreendidos. Nesse sentido, o objetivo principal desse projeto é a obtenção de scaffolds de Al2O3 e de nanocompósitos de Al2O3/ZrO2 que possam apresentar características físico-químicas e morfológicas que, quando implantados nas lesões ou regiões do defeito ósseo, estimulem a osteogênese e levem à formação de estruturas semelhantes aos elementos da matriz extracelular, facilitando a implantação, expansão e integração do tecido ósseo. Para alcançar o objetivo principal, esse projeto foi dividido em três subprojetos. O subprojeto 1 item por objetivo a obtenção de scaffolds de Al2O3 e de Al2O3 contendo 5% em volume de inclusões nanométricas de zircônia (Al2O3/ZrO2) obtido pelas técnicas de gelcasting e impressão 3D, recobertos com fosfatos de cálcio enriquecidos com íons Sr2+ e gentamicina. O subprojeto 2 tem por objetivo recobrir os scaffolds de Al2O3 e Al2O3/ZrO2 com filmes poliméricos carreadores da proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2). O subprojeto 3 tem por objetivo a incorporação de células-tronco mesenquimais (CTM) nos scaffolds obtidos pelos subprojetos 01 e 02, e a análise funcional in vitro e in vivo. Com isso, espera-se obter scaffolds de Al2O3 e de nanocompósitos de Al2O3/ZrO2 biocompatíveis, bioativos e biofuncionais, com potencial utilização na engenharia de tecidual e em terapias de regeneração ósseas nas medicinas veterinária e humana, possibilitando rapidez no tratamento de regiões lesionadas. (AU)

Lesão raquimedular (LRM) se refere à lesão da coluna vertebral, e tem consequências devastadoras para o bem-estar físico, financeiro e psicossocial dos pacientes. As complicações clínicas incluem perda da mobilidade, disfunção urinária, sexual e reprodutiva, espasticidade, perda de sensibilidade e, paradoxalmente, dor neuropática. A dor impacta fortemente no estado de saúde e qualidade de vida desses pacientes, considerando não apenas sua severidade e duração, mas o perfil refratário ao tratamento farmacológico. O tratamento da LRM inclui cirurgia, terapias farmacológicas paliativas e reabilitação, que induzem apenas discretas melhorias clínicas. Nesse contexto, nosso grupo de pesquisa tem demonstrado ao longo dos últimos dez anos, tanto em condições experimentais quanto clínicas, o potencial terapêutico de células tronco mesenquimais (CTMs) na lesão raquimedular e dor neuropática. Em um desses estudos publicado anteriormente por nosso grupo, utilizando modelo experimental de LRM foi observado que CTMs modificadas geneticamente para superexpressar fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-1) - citocina envolvida no desenvolvimento neural e reparo de lesões - promoveu um aumento na expressão de genes antioxidantes e protegeu contra a perda de mielina. Avanços do conhecimento na área de terapia celular indicam que as vesículas extracelulares (VE) derivadas de CTM (VE-CTM), preservam as propriedades terapêuticas dessas células. A utilização terapêutica de VE contorna os riscos e limitações associados às terapias com células vivas, e possui perfil intrínseco para o desenvolvimento de produtos terapêuticos. Entretanto, o desenvolvimento de produtos baseados em VE-CTM requer a superação de obstáculos como o baixo rendimento e produção em condições xeno-free e GMP (Good Manufacturing Practices). Com base no exposto acima, a presente proposta foi delineada para desenvolver um produto terapêutico off-shelf à base de VE-CTM humanas, produzidas em escala otimizada e condições xeno-free e GMP, investigar seu perfil de estabilidade, e validar suas propriedades terapêuticas pré-clínicas na lesão raquimedular e dor neuropática. Paralelamente serão realizados estudos experimentais (in vitro e in vivo) para avaliar o potencial terapêutico de VE derivadas de CTM modificadas geneticamente para superexpressar citocinas. Dados desse projeto, poderão ser aplicados na geração de um produto de terapia celular avançada alogênico, disponibilizando uma abordagem terapêutica inovadora para o tratamento de pacientes com lesão raquimedular e dor neuropática refratária. (AU)

Biocerâmicas porosas denominadas de scaffolds vem sendo estudadas para a substituição e reparação óssea, com propriedades que atendam a funcionalidade e integração entre o biomaterial e o sistema biológico. Biocerâmicas de Al2O3 e Al2O3/ZrO2 são reconhecidas como biomateriais devido suas propriedades mecânicas melhoradas, alta estabilidade química e biocompatibilidade, quando comparada a outros materiais. No entanto, devido à natureza bioinerte da Al2O3 e ZrO2, recobrimentos superficiais são utilizados para melhorar a interação desse biomaterial com o tecido hospedeiro quando implantado, além de poder, liberar íons que estimulem respostas celulares a nível molecular, através de mecanismos ainda não totalmente compreendidos. Nesse sentido, o objetivo principal desse projeto é a obtenção de scaffolds de Al2O3 e de nanocompósitos de Al2O3/ZrO2 que possam apresentar características físico-químicas e morfológicas que, quando implantados nas lesões ou regiões do defeito ósseo, estimulem a osteogênese e levem à formação de estruturas semelhantes aos elementos da matriz extracelular, facilitando a implantação, expansão e integração do tecido ósseo. Para alcançar o objetivo principal, esse projeto foi dividido em três subprojetos. O subprojeto 1 item por objetivo a obtenção de scaffolds de Al2O3 e de Al2O3 contendo 5% em volume de inclusões nanométricas de zircônia (Al2O3/ZrO2) obtido pelas técnicas de gelcasting e impressão 3D, recobertos com fosfatos de cálcio enriquecidos com íons Sr2+ e gentamicina. O subprojeto 2 tem por objetivo recobrir os scaffolds de Al2O3 e Al2O3/ZrO2 com filmes poliméricos carreadores da proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2). O subprojeto 3 tem por objetivo a incorporação de células-tronco mesenquimais (CTM) nos scaffolds obtidos pelos subprojetos 01 e 02, e a análise funcional in vitro e in vivo. Com isso, espera-se obter scaffolds de Al2O3 e de nanocompósitos de Al2O3/ZrO2 biocompatíveis, bioativos e biofuncionais, com potencial utilização na engenharia de tecidual e em terapias de regeneração ósseas nas medicinas veterinária e humana, possibilitando rapidez no tratamento de regiões lesionadas. (AU)

As células derivadas do ligamento periodontal (PDLCs) possuem característica de células mesenquimais e, de acordo com a literatura, há uma heterogeneidade na capacidade de formação de matriz mineralizada extracelular. Porém, estudos publicados do nosso grupo de pesquisa apontam que essa heterogeneidade está relacionada ao perfil epigenético e transcricional distintos, o que pode pré- determinar um dado fenótipo celular. Portanto, os perfis epigenético e transcricional estão fortemente relacionados à aquisição de um fenótipo osteoblástico específico. Os RNAs longos não codificantes (lncRNA), participam da regulação epigenética pela ligação a proteínas regulatórias da cromatina e podem estar envolvidos na modulação de genes osteogênicos. O lncRNA MIR31HG foi escolhido como alvo deste projeto, a partir de análises de bioinformática de dados epigenômicos gerados no último Auxílio (FAPESP/Universidade de Birmingham, UK 2017/07944-5) e nossa hipótese é que ele esteja associado à capacidade reduzida de formação de matriz mineral. Dessa forma, o papel do lncRNA MIR31HG será investigado na regulação epigenética em PDLCs com baixa capacidade de produzir matriz mineral, imortalizadas e editadas por Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/associated nuclease Cas9 (CRISPR-Cas9). O efeito do silenciamento do lncRNA MIR31HG será investigado na formação de matriz mineral in vitro e na relação com o complexo repressivo Polycomb 2 (PRC2), na marca epigenética H3K27me3 e em marcadores osteogênicos, por imunoprecipitação de cromatina, seguida de sequenciamento (ChIP-seq) e níveis proteicos (WB ou MagPix). Os mecanismos epigenéticos são plásticos e reversíveis, podendo ser alternativas promissoras para terapias baseadas em células ou biomoléculas funcionalizando superfícies de implantes ou biomateriais, para o tratamento de diversos defeitos ósseos. (AU)

Existem evidências de que condicionamentos de células-tronco mesenquimais (MSCs) aumentam sua eficácia nos procedimentos de medicina regenerativa. Estudos têm demonstrado que o emprego isolado de diferentes estratégias estimula a diferenciação celular e, em última análise, a formação tecidual. Entre elas, o aumento da expressão ou da exposição de MSCs a fatores de crescimento, modificações da superfície de cultivo e a terapia com fotobiomodulação (FBM). Nesse sentido, nossa hipótese é que a combinação desses estímulos resulta em efeito sinérgico sobre MSCs, capazes de regenerar o tecido ósseo. Portanto, o objetivo deste estudo é avaliar o efeito da terapia utilizando injeção local de MSCs triplamente condicionadas por (1) edição gênica para sobre-expressar BMP-9, (2) cultivo sobre superfícies com microtopografia e (3) FBM com laser sobre a regeneração óssea. Para isso, uma linhagem imortalizada de MSCs derivadas de medula óssea serão geneticamente editadas para sobre-expressar BMP-9 (MSCsBMP-9+) pelo sistema CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein 9). MSCsBMP-9+ cultivadas sobre superfícies com microtopografia serão avaliadas pela expressão proteica de BMP-9, expressão de genes da via das BMPs e da diferenciação osteoblástica. Essas células serão injetadas na concentração de 5´104 células/50 mL de PBS em defeitos de calvária de ratos criados 2 semanas antes da injeção. A FBM será aplicada imediatamente, 48 e 96 h após a injeção (808 nm; 40 mW; 1,42 W/cm2; 4 J/cm2; 3 s; 0,12 J/ponto; 0,028 cm2) e em quatro pontos (um no centro e três equidistantes, ao redor do defeito). A formação óssea será avaliada por microtomografia computadorizada in vivo imediatamente, 2 e 4 semanas após a injeção e por análise histológica ao final de 4 semanas. Os dados quantitativos serão avaliados quanto à aderência à curva normal e homogeneidade de variâncias para selecionar os testes estatísticos adequados (nível de significância de 5%). Os resultados desse estudo poderão contribuir para o estabelecimento de novos tratamentos, baseados em conceitos de terapia celular, para promover a regeneração óssea em sítios desafiadores, com aplicações nas áreas de Cirurgia Buco-Maxilo-Facial, Periodontia, Implantodontia e Ortopedia. (AU)

Existem evidências de que condicionamentos de células-tronco mesenquimais (MSCs) aumentam sua eficácia nos procedimentos de medicina regenerativa. Estudos têm demonstrado que o emprego isolado de diferentes estratégias estimula a diferenciação celular e, em última análise, a formação tecidual. Entre elas, o aumento da expressão ou da exposição de MSCs a fatores de crescimento, modificações da superfície de cultivo e a terapia com fotobiomodulação (FBM). Nesse sentido, nossa hipótese é que a combinação desses estímulos resulta em efeito sinérgico sobre MSCs, capazes de regenerar o tecido ósseo. Portanto, o objetivo deste estudo é avaliar o efeito da terapia utilizando injeção local de MSCs triplamente condicionadas por (1) edição gênica para sobre-expressar BMP-9, (2) cultivo sobre superfícies com microtopografia e (3) FBM com laser sobre a regeneração óssea. Para isso, uma linhagem imortalizada de MSCs derivadas de medula óssea serão geneticamente editadas para sobre-expressar BMP-9 (MSCsBMP-9+) pelo sistema CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein 9). MSCsBMP-9+ cultivadas sobre superfícies com microtopografia serão avaliadas pela expressão proteica de BMP-9, expressão de genes da via das BMPs e da diferenciação osteoblástica. Essas células serão injetadas na concentração de 5´104 células/50 mL de PBS em defeitos de calvária de ratos criados 2 semanas antes da injeção. A FBM será aplicada imediatamente, 48 e 96 h após a injeção (808 nm; 40 mW; 1,42 W/cm2; 4 J/cm2; 3 s; 0,12 J/ponto; 0,028 cm2) e em quatro pontos (um no centro e três equidistantes, ao redor do defeito). A formação óssea será avaliada por microtomografia computadorizada in vivo imediatamente, 2 e 4 semanas após a injeção e por análise histológica ao final de 4 semanas. Os dados quantitativos serão avaliados quanto à aderência à curva normal e homogeneidade de variâncias para selecionar os testes estatísticos adequados (nível de significância de 5%). Os resultados desse estudo poderão contribuir para o estabelecimento de novos tratamentos, baseados em conceitos de terapia celular, para promover a regeneração óssea em sítios desafiadores, com aplicações nas áreas de Cirurgia Buco-Maxilo-Facial, Periodontia, Implantodontia e Ortopedia.

Recessão gengival é uma condição caracterizada pela exposição oral da superfície da raiz devido a um deslocamento da margem gengival apical à junção cemento-esmalte. As consequências mais comuns da recessão gengival são a deterioração da estética dentária, bem como a hipersensibilidade da dentina e até mesmo a perda do dente. Atualmente, um dos procedimentos mais utilizados para o recobrimento radicular é o que é utilizado enxerto do tecido conjuntivo mais retalho posicionado coronalmente (CTG + CAF). Porém, cirurgias que envolvem a coleta de enxerto são demoradas e podem ter uma alta morbidade, devido à necessidade de um segundo local cirúrgico, além de aumentar o desconforto do paciente, sangramento pós-cirúrgico e suprimento limitado de tecido doador. Por esses motivos, são propostas técnicas cirúrgicas alternativas ao CTG + CAF e também o uso de alguns produtos para obter redução das recessões gengivais. Diferente de todos os produtos encontrados no mercado, desenvolvemos um bioenxerto baseado em terapia celular que é composto por um scaffold de ácido hialurônico (AH) e que contém células mesenquimais (CM) incorporadas. Essa biotinta é bioimpressa em uma bioimpressora 3D o que confere escalonabilidade a produção que é totalmente baseada em conceito GMP (Good Manufacturing Practice). Durante a primeira fase de desenvolvimento do bioenxerto foi estabelecido o protocolo de obtenção do biomaterial a base de AH que apresentou textura e condições de bioimpressão e de manuseio. Assim que foram determinadas as condições do biomaterial, foi demonstrado que esse scaffold e o processo de bioimpressão não prejudicam a viabilidade das CMs contidas. Além disso, foi verificado in vitro que o bioenxerto não é citotóxico para células pertencentes a mucosa oral como os queratinócitos gengivais e que promove a proliferação de fibroblastos gengivais humanos (FGH) de maneira dose dependente, sendo, portanto, o bioenxerto com 1,5x105 CMs o que possui maior capacidade de estimular a multiplicação dos FGHs. Somado ao efeito proliferativo do bioenxerto, verificamos in vitro que este produto também é capaz de promover maior migração de FGH. Uma vez que a quantidade de CMs para a obtenção dos resultados biológicos foi determinada e que propriedades biológicas favoráveis foram demonstradas durante a prova de conceito, estudos posteriores são necessários para que seja verificado o efeito terapêutico dos bioenxertos no tratamento de modelos de recessão gengival in vivo, focando as análises nos parâmetros exigidos pela ANVISA para a liberação dos testes em humanos futuramente. Além disso, também objetivando a entrada deste produto no mercado é necessário estabelecer as condições adequadas para armazenamento e transporte dos bioenxertos para que os mesmos sejam configurados como produtos viáveis. (AU)